Genòmica Funcional

Herbert Auer

Cap de Unitat

Tel Oficina : +34 93 40 39803

correu-e : herbert.auerirbbarcelona.org

Introducció

La Plataforma de Genòmica Funcional de l'IRB Barcelona (FGC) ofereix serveis a investigadors d'institucions públiques així com de la indústria. Oferim un suport integral a qualsevol projecte que requereixi la mesura de DNA i RNA a nivell del genoma complet i quan la manipulació de l'expressió gènica és necessària.

Eines per a l'anàlisi genòmica

La plataforma ofereix eines per a:

• miRNAs
• Transcriptòmica
• Variació del nombre de còpies de DNA
• Chip-Seq
• Seqüenciació genòmica
• SNPs

La mesura en el genoma complet de les alteracions en el DNA o en l'expressió gènica a nivell de RNA pot suposar un repte per als projectes de recerca. La plataforma ofereix un servei complet per a treballar amb els investigadors durant tot el projecte. A banda d'eines d'avantguarda com els microarrays d’Affymetrix i NimbleGen i la ultraseqüenciació d’Illumina, la plataforma també ofereix serveis de consulta en referència a l'anàlisi genòmica.

Alteració de l'expressió gènica

El FGC posa a disposició dels investigadors de l'IRB Barcelona i de l’IBMB (CSIC) els següents clons:

• shRNAs humans
• shRNAs de ratolí
• ORF humans (únicament per a l'IRB Barcelona)

La genètica inversa requereix eines eficients per alterar l'expressió gènica. El FGC ofereix prop de 200.000 clons per la manipulació genètica. Aquests inclouen tots els clons de shRNAs humans i de ratolí de la TRC1 de Sigma per a la reducció de l'expressió, juntament amb clons ORF humans d'Open Biosystems per la sobreexpressió. Els clons ORF també són útils com a sondes per a l’hibridació in situ o Northern blots.

Els clons de shRNAs venen en vectors lentivirals per la infecció eficient de moltes línies cel·lulars, incloent les que no es divideixen.

Els clons ORF contenen el sistema "Gateway" per ser transferits a qualsevol tipus de vector.

Més informació

• 2009 Scientific Report - Functional Genomics Core Facility
• 2008 Scientific Report - Functional Genomics Core Facility
• 2007 Scientific Report - Functional Genomics Core Facility

Genòmica Funcional

Eines per a l’anàlisi genòmica

Determinar el tipus d'eines d'anàlisi genòmica més adients per una qüestió específica depèn de la naturalesa de la qüestió. En general, la resolució de qüestions relacionades amb transcrits coneguts i ben caracteritzats (mRNAs i miRNAs) és més senzilla utilitzant microarrays. El descobriment de gens i la caracterització de materials ChIP es fa de forma més eficient per seqüenciació. Alguns dels temes pels quals ens pregunten més sovint es descriuen aquí:

RNA

Anàlisi de microRNA
El FGC disposa del miRNA GeneChip d'Affymetrix per l'anàlisi de miRNA. Per a més de 70 organismes, es porta a terme en un sol array una anàlisi exhaustiva dels miRNAs coneguts. Quantitat mínima: 250ng de RNA total.

El descobriment de nous small RNAs (miRNAs, piRNA i altres tipus de small RNAs) es realitza de forma més eficient per seqüenciació. Quantitat mínima: 100ng de RNA total.

Patró d'expressió de mRNA
Per a més de 20 organismes, la plataforma ofereix arrays d’Affymetrix per l'estudi del patró d'expressió de mRNA. Aquests arrays són una eina robusta i fiable per quantificar l'expressió de la majoria dels gens coneguts. Quantitat mínima: 50ng de RNA total per arrays ST, 5 ng per arrays 3 '.

Per a més de 100 organismes disposem dels arrays de NimbleGen per a l'obtenció del patró d'expressió de mRNA. Aquests arrays són especialment adients per genomes petits perquè es poden analitzar múltiples mostres en un sol array i reduir així el cost global. Quantitat mínima: 1000 ng de RNA total.

RNA-Seq
Es tracta d’una tècnica que, per naturalesa, es porta a terme per seqüenciació i que permet la caracterització de splicing alternatiu, llocs d'inici i d’acabament i el descobriment de nous transcrits. El processament de les mostres i l'anàlisi de dades són molt experimentals i encara no segueixen procediments normalitzats. Quantitat mínima: 5000 ng de RNA total

DNA

Variació del nombre de còpia de DNA (anàlisi CNV)
L'anàlisi CNV a resolució de 10 o 100 kb es porta a terme en tots els organismes en què els arrays d'expressió estiguin disponibles en Affymetrix o NimbleGen. A més, NimbleGen ofereix un ampli espectre d'arrays dedicats a l'anàlisi CNV per un nombre elevat d’organismes. Quantitat mínima: 5.000 ng de DNA genòmic.

L'anàlisi CNV també es porta a terme per seqüenciació del genoma, especialment en organismes amb un genoma petit (Drosophila, llevat, etc.). Juntament amb informació del CNV, en un mateix experiment també s’estudien molts altres tipus d'alteracions genètiques (mutacions puntuals, indels, translocacions, inversions). Quantitat mínima: 5000 ng de DNA genòmic.

ChIP-Seq
La caracterització dels llocs d'unió dels factors de transcripció i la localització de les modificacions de les histones es fa millor per seqüenciació del material ChIP. En organismes amb un genoma complex com l'humà o el del ratolí, la línia de base òptima (anticossos control, input de ChIP) encara no ha estat determinada. Quantitat mínima: 10 ng de DNA ChIP.

Metilació del DNA
L'anàlisi de múltiples loci per la metilació del DNA encara està en fase experimental. Per a projectes específics relatius a la metilació del DNA, si us plau contacteu-nos.

Alteració de l'expressió de gens

La genètica reversa requereix eines eficients per alterar l'expressió gènica. El FGC posa a disposició dels investigadors de l'IRB Barcelona i de l’IBMB (CSIC) gairebé 200.000 clons per la manipulació genètica. Aquests inclouen tots els clons de Sigma TRC1 per a humans i ratolins per disminuir l'expressió i els clons d’ORF humans d'Open Biosystems per la sobreexpressió (només per usuaris de l'IRB Barcelona). Els clons ORF també són útils com a controls per hibridació in situ i Northern blots.

shRNAs humans i de ratolí
Els clons de shRNA estan disponibles en vectors lentivirals per la infecció eficient de moltes línies cel·lulars, incloent les que no es divideixen. De mitjana, oferim als nostres usuaris interns de 4 a 5 clons diferents per gen. En molts casos, els clons que afecten a un mateix gen ofereixen diferents eficiències de disminució de l'expressió i ajuden a controlar els efectes inespecífics. Aproximadament el 75% de tots els gens refseq humans i de ratolins tenen un clon. La llista completa dels clons shRNA està disponible a www.dnaarrays.org. Hi ha informació detallada sobre els clons TRC1 a la pàgina web de Sigma Aldrich.

Clons ORF humans
La llibreria d’ORF d'Open Biosystems ofereix als investigadors de l'IRB Barcelona aproximadament 13.000 clons per l’expressió d'un ORF per gen. Aquests clons s'utilitzen sovint per la sobreexpressió dels gens, però també es poden fer servir com a control. Els clons ORF contenen el sistema "Gateway" per una transferència sense problemes a qualsevol tipus de vector.

La llista dels clons ORF disponibles es pot consultar a www.dnaarrays.org. Hi ha informació detallada sobre els clons ORF disponibles a la pàgina web d’ORF d'Open Biosystems.

Genòmica Funcional

General

Consulta inicial
Abans de començar el seu experiment, el convidem a parlar del disseny experimental amb nosaltres.

Requeriments per als serveis
Cada servei (distribució de clons, anàlisi de microarrays, seqüenciació ...) té les seves pròpies especificacions; els detalls estan indicats en els formularis de sol·licitud dels serveis específics. Els formularis es poden descarregar des de la nostra pàgina web www.dnaarrays.org.

Qui pot dur a terme projectes amb el FGC?
La plataforma de FGC està disponible tant per a investigadors interns com externs. Treballem amb institucions públiques així com companyies privades.

Com està organitzat el pagament dels serveis al FGC?
La plataforma disposa de dues tarifes, una aplicable als investigadors de l'IRB Barcelona i una altra per entitats externes. La nostra política principal és molt transparent: només cal descarregar els nostres formularis de sol·licitud, escriure el nombre de mostres que li agradaria processar en una plataforma determinada i el preu es mostra automàticament. Per a investigadors espanyols: el govern encara no concedeix als instituts de recerca un estatus lliure d'impostos. Per tant, l'IVA ha de ser afegit als preus mostrats.

Eines per a l'anàlisi genòmica

Quant trigaran a arribar els resultats?
Per projectes petits de microarrays (<24 mostres), les dades poden estar disponibles 3 setmanes després de lliurar les mostres i el formulari de sol·licitud. En cas de tractar-se d’arrays especials, Affymetrix i NimbleGen poden trigar més en fer l’entrega.

En cas de tractar-se de projectes de seqüenciació no es pot fer una estimació del temps per diverses raons: Illumina no emmagatzema consumibles a Europa; per aquest motiu, i per altres raons internes d’Illumina, els nostres encàrrecs poden patir endarreriments. Cal tenir en compte que un seqüenciador processa 8 mostres en paral·lel. Totes han de tenir la mateixa longitud de lectura i ser del mateix tipus (single-end o pair-end). Les cel de flux han d'estar completes per garantir el preu indicat en els nostres formularis. Això significa que o bé l'usuari pot omplir una cel de flux sencera amb les seves mostres o esperar que altres usuaris desitgin fer alguna cosa semblant.

Quins organismes poden ser analitzats?
Qualsevol organisme amb un genoma (o transcriptoma) ben conegut pot ser analitzat. En el camp dels microarrays, es poden comprar arrays estàndard per molts organismes. Affymetrix cobreix més de 20 organismes, NimbleGen prop de 100. Els arrays també poden ser personalitzats. Això és normalment més fàcil amb NimbleGen que amb Affymetrix. En el camp de la ultraseqüenciació, és necessari que un genoma de referència del microorganisme estigui disponible. Les seqüències es mapegen en base a aquest genoma de referència.

Quina és la millor manera de preparar les meves mostres?
En general, una combinació d'extracció de fase orgànica (fenol) amb purificació de columna (ex. Quiagen) funciona millor. Aquests dos tipus de principis de purificació totalment diferents eliminen totes les impureses. Els protocols es poden trobar a la nostra pàgina web. Per a l’anàlisi de miRNA no s'han d'utilitzar columnes, ja que gairebé totes eliminen RNAs curts. Per mostres molt petites (uns pocs centenars de cèl·lules) calen protocols específics que també estan disponibles a la nostra web http://www.dnaarrays.org.

Tinc dubtes sobre la qualitat de les meves mostres. Encara puc enviar-les a analitzar?
Abans de començar un experiment costós com els arrays o seqüenciacions realitzem una àmplia gamma de controls de qualitat. Aquests inclouen el test en NanoDrop per la puresa, el test de la integritat del RNA al Bioanalyzer i la quantificació específica de DNA o RNA a través dels assaigs Qubit. En cas de dubtes sobre les mostres ens posem en contacte amb l'usuari.

Alteració de l'expressió gènica

Qui pot demanar clons?
L’IRB Barcelona té un contracte d'exclusivitat amb Sigma i Open Biosystems i, per tant, només els investigadors de l'IRB Barcelona i de l’IBMB-CSIC tenen accés a les llibreries Sigma, mentre que únicament els de l'IRB Barcelona poden accedir a Open Biosystems. Si l'usuari treballa per una altra organització ha de contactar directament amb Sigma i /o Open Biosystems per accedir als clons.

Per a quins gens hi ha clons shRNA o ORF disponibles?
Els nostres clons shRNA cobreixen aproximadament el 75% dels mRNAs refseq d'humans i de ratolins; els clons ORF cobreixen el mateix percentatge de gens humans. A la nostra pàgina web es pot trobar una llista completa dels clons i els seus corresponents gens.

No puc obrir la llista de clons perquè està en format xlsx
Les llibreries contenen més de 65.535 clons. Per tant, es requereix Excel 2007 per obrir més de 65.535 files.

No puc trobar el meu gen preferit en la seva llista de clons
Les nostres llistes contenen els noms oficials dels gens tal com estan disponibles a la pàgina web de NCBI. En cas de no trobar el gen cal anar a la web de NCBI i en el camp de cerca fer clic en el gen i comprovar si s'ha utilitzat el nom oficial.

Quant de temps passa fins que es reben els clons?
L'informarem sobre quan haurien de ser lliurats els tubs per inoculació bacteriana després de rebre la petició del clon per email. Els clons es reben el mateix dia que es fa el lliurament dels tubs. El procés triga un màxim de tres dies.

Genòmica Funcional

© Photos by Gianluca Battista/Massimiliano Minocri

Cap de Unitat
Herbert Auer
tel +34 93 40 39803
e-mail: herbert.auerirbbarcelona.org

Tècnics d'Investigació Senior
Annie Rodolosse
tel +34 93 40 39803
e-mail: annie.rodolosseirbbarcelona.org

Tècnics d'Investigació
José Ignacio Pons
tel +34 93 40 34550
e-mail: nacho.ponsirbbarcelona.org

Tècnics Especialistes
David Fernández
tel +34 93 40 34550
e-mail: david.fernandezirbbarcelona.org

Genòmica Funcional

Waves of early transcriptional activation and pluripotency program initiation during human preimplantation development.
Vassena R, Boué S, González-Roca E, Aran B, Auer H, Veiga A, Izpisua Belmonte JC.
Development, In press (2011)

The DNA-Proteome: Recent advances towards establishing the protein-DNA interaction space
Grotewold E and Auer H.
Int J Comput Bioscience, 1, 1008 (2010)

Accurate expression profiling of very small cell populations
Gonzalez-Roca E, Garcia-Albéniz X, Rodriguez-Mulero S, Gomis RR, Kornacker K and Auer H
PLoS ONE, 5 (12)-e14418 (2010)

Expression Profiling Using Affymetrix GeneChip Microarrays
Auer H, Newsom DL and Kornacker K.
Methods Mol Biol, 509, 35-46 (2009)

Autism-specific copy number variants further implicate the phosphatidylinositol signaling pathway and the glutamatergic synapse in the etiology of the disorder
Cuscó I, Medrano A, Gener B, Vilardell M, Gallastegui F, Villa O, González E, Rodríguez-Santiago B, Vilella E, Del Campo M and Pérez-Jurado LA.
Hum Mol Genet, 18, 1795-1804 (2009)

Innate and adaptive immune activation in the brain of MPS IIIB mouse model
DiRosario J, Divers E, Wang C, Etter J, Charrier A, Jukkola P, Auer H, Best V, Newsom DL, McCarty DM and Fu H.
J Neurosci Res, 87 (4), 978-990 (2009)

Expression divergence and copy number variation in the human genome
Auer H.
Cytogenet Genome Res, 123 (1-4), 278-282 (2008)

Islet graft response to transplantation injury includes upregulation of protective as well as apoptotic genes
Rodríguez-Mulero S and Montanya E.
Cell Transplant, 17 (9), 1025-1034 (2008)

Array-CGH in patients with Kabuki-like phenotype: identification of two patients with complex rearrangements including 2q37 deletions and no other recurrent aberration
Vilardell M, González E, Gener B, Galán E, Toledo L and Pérez-Jurado LA.
BMC Med Genet, 11 (27) (2008)

Analysis of cytogenetic abnormalities in squamous cell carcinoma by array comparative genomic hybridization
Salgado R, Toll A, Espinet B, González-Roca E, Barranco CL, Serrano S, Solé F and Pujol RM.
Actas Dermosifiliogr, 99 (3), 199-206 (2008)

Transcriptional profiling of the megabladder mouse: a unique model of bladder dysmorphogenesis
Singh S, Robinson M, Ismail I, Saha M, Auer H, Kornacker K, Robinson ML, Bates CM and McHugh KM.
Dev Dyn, 273 (1), 170-186 (2008)

HOXB4's road map to stem cell expansion
Schiedlmeier B, Santos AC, Ribeiro A, Moncaut N, Lesinski D, Auer H, Kornacker K, Ostertag W, Baum C, Mallo M and Klump H.
Proc Natl Acad Sci USA, 104, 16952-16957 (2007)

Disruption of ZAS3 in mice alters NF-kappaB and AP-1 DNA binding and T-cell development
Allen CE, Richards J, Muthusamy N, Auer H, Liu Y, Robinson ML, Barnard JA and Wu LC.
Gene Expr, 14 (2), 83-100 (2007)

Big results from small samples: evaluation of amplification protocols for gene expression profiling
Viale A, Li J, Tiesman J, Hester S, Massimi A, Griffin C, Grills G, Khitrov G, Lilley K, Knudtson K, Ward B, Kornacker K, Chu CY, Auer H and Brooks AI.
J Biomol Tech, 18 (3), 150-161 (2007)

Gene-resolution analysis of DNA copy number variation using oligonucleotide expression microarrays
Auer H, Newsom DL, Nowak NJ, McHugh KM, Singh S, Yu CY, Yang Y, Wenger GD, Gastier-Foster JM and Kornacker K.
BMC Genomics, 8, 111 (2007)

Gene expression and functional evidence of epithelial-to-mesenchymal transition in papillary thyroid carcinoma invasion
Vasko V, Espinosa AV, Scouten W, He H, Auer H, Liyanarachchi S, Larin A, Savchenko V, Francis GL, de la Chapelle A, Saji M and Ringel MD.
Proc Natl Acad Sci USA, 104 (8), 2803-2808 (2007)

Quantification of DNA methylation in electrofluidics chips (Bio-COBRA)
Brena RM, Auer H, Kornacker K and Plass C.
Nat Protoc, 1 (1), 52-58 (2006)

ADOA3R as a therapeutic target in experimental colitis: proof by validated high-density oligonucleotide microarray analysis
Guzman J, Yu JG, Suntres Z, Bozarov A, Cooke H, Javed N, Auer H, Palatini J, Hassanain HH, Cardounel AJ, Javed A, Grants I, Wunderlich JE and Christofi FL.
Inflamm Bowel Dis, 12 (8), 766-789 (2006)

20q11.1 amplification in giant-cell tumor of bone: Array CGH, FISH, and association with outcome
Smith LT, Mayerson J, Nowak NJ, Suster D, Mohammed N, Long S, Auer H, Jones S, McKeegan C, Young G, Bos G, Plass C and Morrison C.
Genes Chromosomes Cancer, 45 (10), 957-966 (2006)

The ABRF MARG microarray survey 2005: taking the pulse of the microarray field
Knudtson KL, Auer H, Brooks AI, Griffin C, Grills G, Hester S, Khitrov G, Lilley KS, Massimi A, Tiesman JP and Viale A.
J Biomol Tech, 17 (2), 176-186 (2006)

Accurate quantification of DNA methylation using combined bisulfite restriction analysis coupled with the Agilent 2100 Bioanalyzer platform
Brena RM, Auer H, Kornacker K, Hackanson B, Raval A, Byrd JC and Plass C.
Nucleic Acids Res, 34 (3), e17 (2006)

MYC amplification and polysomy 8 in chondrosarcoma: array comparative genomic hybridization, fluorescent in situ hybridization, and association with outcome
Morrison C, Radmacher M, Mohammed N, Suster D, Auer H, Jones S, Riggenbach J, Kelbick N, Bos G and Mayerson J.
J Clin Oncol, 23 (26), 9369-9376 (2005)

Role of cancer-associated stromal fibroblasts in metastatic colon cancer to the liver and their expression profiles
Nakagawa H, Liyanarachchi S, Davuluri RV, Auer H, Martin EW Jr, de la Chapelle A and Frankel WL.
Oncogene, 23 (44), 7366-7377 (2004)

Acute myeloid leukemia with complex karyotypes and abnormal chromosome 21: Amplification discloses overexpression of APP, ETS2, and ERG genes
Baldus CD, Liyanarachchi S, Mrozek K, Auer H, Tanner SM, Guimond M, Ruppert AS, Mohamed N, Davuluri RV, Caligiuri MA, Bloomfield CD and de la Chapelle A.
Proc Natl Acad Sci USA, 101 (11), 3915-3920 (2004)

Tissue-wide expression profiling using cDNA Subtraction and Microarrays to identify tumor-specific genes
Amatschek S, Koenig U, Auer H, Steinlein P, Pacher M, Gruenfelder A, Dekan G, Vogl S, Kubista E, Heider KH, Stratowa C, Schreiber M and Sommergruber W.
Cancer Res, 64 (3), 844-856 (2004)

Genòmica Funcional

• 22 Juliol 2011
  Notícia Científica
  Els embrions "s’independitzen" aviat durant el desenvolupament
  

  Els resultats de la investigació podrien revolucionar la medicina reproductiva i l’estudi amb cèl·lules mare en humans.

• 21 Gener 2011
  Notícia Científica
  10 cèl·lules són suficients per a realitzar estudis fiables d’activitat gènica
  

  Descriuen un nou mètode que permet l’anàlisi de l’expressió gènica de cèl·lules poc abundants als organismes.

• 25 Febrer 2010
  International Journal of Computational Bioscience
  El Proteoma del DNA