Plataformes científiques i Serveis
Expressió de proteïnes
Introducció
La plataforma científica d’expressió de proteïnes de l’IRB Barcelona posa a l’abast de la comunitat científica un ampli ventall de serveis d’alt rendiment (High Through-Put o HTP). La capacitat dels mètodes HTP per a clonar i rastrejar l’expressió d’un elevat nombre de constructes en paral·lel és una eina d’una utilitat immensa, ja que ofereix solucions a problemes vinculats a l’expressió de proteïnes. Això s’aconsegueix expandint de forma eficaç el nombre de variables disponibles per a cada projecte d’investigació.
La plataforma ofereix els següents serveis:
Clonació HTP a mida per generar vectors d’expressió
La plataforma serà capaç de generar en una placa de microtitració 96 clons d’expressió diferents en un marge d’una a dues setmanes un cop rebudes les mostres (ADN motllo i primers). La placa pot estar formada per: constructes de moltes proteïnes diana d’un únic organisme sotmès a anàlisi (per exemple, per estudis de genòmica estructural), de múltiples constructes d’una proteïna més complicada, on l’expressió pot haver estat difícil i l’investigador busca explorar més opcions. Es podran dissenyar constructes amb supressions N o C-terminal de les proteïnes en combinació amb una elecció de proteïnes de ‘fusió’ (per exemple, Maltose Binding Protein, MBP, Glutathione-S-Transferase, GST, o Small Ubiquitin-like Modifier, SUMO) per ajudar en la solubilitat i rendiment de les proteïnes d’interès. Per generar aquests constructes d’expressió es farà anar la tècnica de clonació In-Fusion™ i la col·lecció pOPIN1 de vectors. Per tal de simplificar els rastreig en paral·lel de l’expressió i la purificació de les proteïnes, aquests vectors inclouen una cua His6 en tots els constructes.
Rastreig de l’expressió en E. coli
El temps d’anàlisi d’una placa de microtitració de 96 clons d’expressió (de la PECF o de l’usuari) és d’ aproximadament una setmana. Inicialment implica l’ús de dos soques d’expressió, i l’anàlisi de l’expressió a cada soca mitjançant l’ús d’ IPTG i l’auto-inducció. En cas necessari es poden incorporar soques addicionals d’ E. coli en el procés de rastreig.
Rastreig d’expressió en cèl·lules d’origen mamífer, per exemple HEK293
Un plat de microtitració de 96 clons d’expressió (de la PECF o de l’usuari) es pot analitzar en cèl·lules HEK293 en un període d’una a dues setmanes. La introducció d’aquest procés es posarà en marxa durant el primer trimestre del 2009.
Altres serveis que s’introduiran durant el 2009 inclouen: la generació de baculovirus recombinant, el rastreig de l’expressió en cèl·lules Sf9, la producció a mida de vectors així com vectors per rastreig d’expressió en P. pastoris o K. lactis.
Per a rebre més informació sobre la plataforma científica, enviï un email a
nick.berrow
irbbarcelona.org
1 El vector pOPIN va ser desenvolupat a l’Oxford Protein Production Facility. Per a més informació veure també: Berrow NS, Alderton D, Sainsbury S, Nettleship J, Assenberg R, Rahman N, Stuart DI and Owens RJ. A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications. Nucleic Acids Res, 35, e45 (2007)
In-Fusion™ és una marca registrada de Clontech Laboratories, Inc.
Més informació
RSS
