Expressió de Proteïnes / Plataformes científiques i Serveis / IRB Barcelona

Expressió de proteïnes

Nicholas Simon Berrow

Cap de Unitat

Tel Oficina : +34 93 40 20263

correu-e : nick.berrowirbbarcelona.org

Introducció

La Plataforma Científica d'Expressió de Proteïnes ofereix serveis d’alt rendiment (High-throughput o HTP) pel clonatge i les proves d’expressió proteica amb els quals es poden analitzar moltes variables en paral·lel: per exemple, diferents truncaments o mutacions d’una mateixa proteïna, diferents proteïnes de fusió, diferents medis de cultiu o soques d’expressió, etc. Tanmateix, aquests serveis HTP també poden servir per la clonació i l’anàlisi de l’expressió d’un gran nombre de proteïnes diferents del genoma d’un organisme particular o d’una família d’organismes.

La plataforma ofereix a més la possibilitat de produir i purificar grans quantitats de proteïna (de l’ordre de mil·ligrams), tant en sistemes d’expressió de proteïnes procariotes com eucariotes: E. coli, Sf9 (per expressió amb Baculovirus) i HEK293T o HEK293A (cèl·lules de mamífer).

Molts dels protocols de la Plataforma estan automatitzats gràcies a l’ús de la robòtica per dispensar líquids i per la manipulació de plaques de microtitració (MTP) per als screenings a petita escala (Theonyx). També per la purificació de proteïnes a gran escala (mg), gràcies a un sistema de purificació automatitzada (Äkta Xpress).

Figura 1 (a dalt). Els vectors pPEU desenvolupats a la Plataforma poden ser emprats per analitzar l’expressió de proteïnes i la seva localització en cèl·lules HEK293T; a la imatge: dues proteïnes fusionades a la proteïna fluorescent Cherry es visualitzen per microscopia de fluorescència.

(A baix a l’esquerra) Purificació automatitzada a gran escala de proteïnes secretades i glicosilades partint de medi de cultiu de cèl·lules HEK293T; a la imatge: gels SDS-PAGE de dos productes finals.

(A baix a la dreta) Purificació de complexes de proteïnes expressats en E. coli a partir de vectors bi-cistrònics; a la imatge: SDS-PAGE d’un complex purificat.

La plataforma ofereix molts reactius d’alta qualitat per al clonatge i l’expressió de proteïnes, a més de soques d’E. coli altament competents i resistents a bacteriòfags, medis de cultiu específics per a l’expressió de proteïnes, i enzims proteolítics recombinants. Si es requereix, la plataforma també ofereix serveis de modificació de vectors i de clonatge personalitzats.

Contacte

Per a informació més detallada o qualsevol consulta, contacti amb nosaltres:
nick.berrowirbbarcelona.org

Més informació

Expressió de proteïnes

Clonació HTP a mida per generar vectors d’expressió
La tècnica de clonatge In-Fusion ™ és independent d’enzims de restricció i lligament, i permet la producció precisa de constructes definits per l’usuari, ja siguin constructes mutants, quimèrics o bi-cistrònics. Per això disposem a la Plataforma d’una àmplia gamma de vectors pOPIN1 o pPEU disponibles per al seu ús amb In-Fusion ™ (veure aquí la llista completa o contacti amb nosaltres). La majoria d’aquests vectors permeten l’expressió tant en E. coli (promotors basats en T7), com en cèl·lules de mamífer (inmediate early enhancer de CMV fusionat al promotor de la β-actina de pollastre) o cèl·lules d'insecte (promotor p10 i recombinació in cell dels ORF 603 i 1629 al genoma de baculovirus), amb el qual l’expressió d’un únic clon pot ser analitzada en tots els organismes disponibles a la Plataforma. Generalment, l’investigador proporcionarà l’ADN motlle per al clonatge, tot i que la plataforma també pot proveir plàsmids o cDNAs.
Mini-preparació de plàsmid HTP
Preparació de 96 mini-preps partint de pelets d'E. coli en plaques de microtitració (MTP) en poques hores.
Anàlisi de l'expressió en E. coli
L’screening de l’expressió en E. coli de 96 clons es pot dur a terme tan sols en una setmana, gràcies a l’ús de Theonyx i MTPs. Actualment, l’screening general inclou dues soques d’expressió en les quals l’expressió s’indueix a partir de dos mètodes diferents: afegint IPTG o amb un medi de cultiu d’autoinducció. Si cal, també es poden incloure altres soques (DE3) d'E. coli a l’screening.
Anàlisi de l’expressió en cèl·lules de mamífer (p. ex. HEK293T)
L’screening de l’expressió dels clons en una MTP de 96 pouets es pot dur a terme en 1-2 setmanes.
Expressió a gran escala i purificació personalitzada de proteïnes
L’expressió a gran escala i purificació personalitzada de l’ordre de mil·ligrams, tant en proteïnes intracel·lulars com secretades, es porta a terme incloent un mínim de dos passos de purificació, que generalment ens dóna un grau de puresa de més del 95% per la majoria de proteïnes. Per aquesta expressió a gran escala, els sistemes d’expressió actualment disponibles a la plataforma són:
- Diferents soques d’E. coli
- Cèl·lules de mamífer HEK293A
- Cèl·lules de mamífer HEK293T; amb aquestes cèl·lules hem purificat amb èxit mil·ligrams de proteïnes glicosilades secretades.
Estem posant a punt cultius de cèl·lules d’insecte com a sistema d’expressió a gran escala per incloure’l a la nostra llista de serveis.
Producció en E. coli de proteïnes marcades amb ¹⁵N per la determinació estructural per RMN
Producció de proteïnes marcades amb seleno-metionina en soques d'E. coli auxòtrofes o protòtrofes per la determinació estructural per cristal·lografia
El gran volum de seleno-metionina que comprem fa que les nostres proteïnes d'E. coli marcades amb Se-Met tinguin un preu molt competitiu.
Proteases recombinants amb cua d’histidines: 3C (PreScission), TeV i SUMO
Aquestes proteases són àmpliament utilitzades per la separació de les proteïnes o cues de fusió de les proteïnes d’interès, i són fàcilment eliminades de la mostra gràcies a la seva pròpia cua d’histidines.
Producció de baculo-virus recombinants
Aquesta producció es pot dur a terme partint tant de vectors pOPIN o pPEU, com de constructes existents (p. ex. pFastBac). La recombinació in-cell (Sf9) dels vectors pOPIN i pPEU amb el genoma baculoviral és ràpida i sense background.

Properament també disposarem de les glicosidases PNGasa i EndoF1 per l’eliminació de part dels sucres de les proteïnes recombinants glicosilades com a pas previ a la cristal·lització.

La plataforma també ofereix molts reactius d’alta qualitat, com cèl·lules altament competents de diferents soques d’E. coli, reactius per la clonació, l’expressió i el marcatge de proteïnes, etc. Tot a disposició dels altres investigadors de l’IRB Barcelona a preus molt competitius.

¹- El vector pOPIN es va desenvolupar a l'Oxford Protein Production Facility, veure també:
Berrow NS, Alderton D, Sainsbury S, Nettleship J, Assenberg R, Rahman N, Stuart DI and Owens RJ. A Versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications. Nucleic Acids Res, 35, E45 (2007) In-Fusion ™ is a trademark of Clontech Laboratories, Inc

²- El rendiment depèn íntegrament de la proteïna en concret que s’estigui expressant, i per tant, no es pot garantir.

Expressió de proteïnes

Generalment duem a terme diferents fases de diferents projectes al mateix temps, i intentem allotjar qualsevol petició raonable tan aviat com ens sigui possible.

Si us plau no dubti en consultar-nos per qualsevol pregunta relativa a possibles projectes o col·laboracions amb la Plataforma Científica d'Expressió de Proteïnes.