Plataformas Científicas y Servicios
Plataformas Científicas y Servicios
Genómica funcional
Herbert Auer
Jefe de Unidad
Tel Oficina : +34 93 40 39803
correo-e : herbert.auer
irbbarcelona.org
Introducción
La Plataforma de Genómica Funcional del IRB Barcelona (FGC) sirve a investigadores de instituciones públicas así como de la industria. Ofrecemos un apoyo completo a cualquier proyecto que requiera la medición de DNA y RNA a nivel de genoma completo y cuando la manipulación de la expresión génica es necesaria.
Herramientas para el análisis genómico
La plataforma ofrece herramientas para:
- miRNAs
- Transcriptómica
- Variación del número de copias de DNA
- Chip-Seq
- Secuenciación genómica
- SNPs
La medición en el genoma completo de alteraciones en el DNA o en la expresión génica a nivel de RNA puede ser un desafío para los proyectos de investigación. La plataforma ofrece un servicio completo para trabajar con los investigadores durante todo el proyecto. Además de herramientas de vanguardia como los microarrays de Affymetrix y NimbleGen y la ultrasecuenciación de Illumina, la plataforma ofrece servicio de consulta en referencia al análisis genómico.
Alteración de la expresión génica
El FGC pone a disposición de investigadores del IRB Barcelona y el IBMB (CSIC) los siguientes clones:
- shRNAs humanos
- shRNAs de ratón
- ORF humanos (únicamente para el IRB Barcelona)
La genética reversa requiere herramientas eficientes para alterar la expresión génica. El FGC ofrece cerca de 200.000 clones para manipulación genética. Estos incluyen todos los clones de shRNAs humanos y de ratón de la TRC1 de Sigma para la reducción de la expresión, junto con clones ORF humanos de Open Biosystems para la sobreexpresión. Los clones ORF también son útiles como sondas para hibridación in situ o Northern blots.
Los clones de shRNAs vienen en vectores lentivirales para la infección eficiente de muchas líneas celulares, incluyendo las que no se dividen.
Los clones ORF contienen el sistema “Gateway” para su transferencia a cualquier tipo de vector.
Más información
Genómica funcional
Herramientas para el análisis genómico
Determinar el tipo de herramientas de análisis genómico más adecuadas para una cuestión específica depende de la naturaleza de la cuestión. En general, la resolución de cuestiones relacionadas con transcritos conocidos y bien caracterizados (mRNAs y miRNAs) es más sencilla utilizando microarrays. El descubrimiento de genes y la caracterización de materiales ChIP se hace de forma más eficiente por secuenciación. Algunos de los temas por los que nos preguntan más menudo se describen aquí:
RNA
Análisis de microRNA
El FGC ofrece el miRNA GeneChip de Affymetrix para el análisis de miRNA. Para más de 70 organismos, un análisis exhaustivo de los miRNAs conocidos se lleva a cabo en un sólo array. Mínima cantidad: 250ng de RNA total.
El descubrimiento de nuevos small RNAs (miRNAs, piRNAs y otros tipos de small RNAs) se realiza de forma más eficiente por secuenciación. Mínima cantidad: 100ng de RNA total.
Patrón de expresión de mRNA
Para más de 20 organismos, proveemos arrays de Affymetrix para el estudio del patrón de expresión de mRNA. Estos arrays son una herramienta robusta y fiable para cuantificar la expresión de la mayoría de los genes conocidos. Mínima cantidad: 50ng de RNA total para arrays ST, 5 ng para arrays 3’.
Para más de 100 organismos, proveemos los arrays de NimbleGen para la obtención del patrón de expresión de mRNA. Estos arrays son especialmente adecuados para genomas pequeños ya que múltiples muestras pueden ser analizadas en un solo array, reduciendo así el coste. Mínima cantidad: 1000 ng de RNA total.
RNA-Seq
Por naturaleza, esta técnica se lleva a cabo por secuenciación. Permite la caracterización de splicing alternativo, sitios de inicio y terminación y el descubrimiento de nuevos transcritos. El procesamiento de las muestras y el análisis de datos son muy experimentales y todavía no siguen procedimientos normalizados. Mínima cantidad: 5000 ng de RNA total
DNA
Variación del número de copia de DNA (análisis CNV)
El análisis CNV a resolución de 10 o 100 kb se lleva a cabo en todos los organismos cuyos arrays de expresión estén disponibles en Affymetrix o NimbleGen. Además, NimbleGen ofrece un amplio espectro de arrays dedicados al análisis CNV para muchos organismos. Mínima cantidad: 5000 ng de DNA genómico.
El análisis CNV también se lleva a cabo por secuenciación del genoma, especialmente en organismos con un genoma pequeño (Drosophila, levadura, etc.). Junto con información del CNV, muchos otros tipos de alteraciones genéticas (mutaciones puntuales, InDels, translocaciones, inversiones) son estudiados en el mismo experimento. Mínima cantidad: 5000 ng de DNA genómico.
ChIP-Seq
La caracterización de los sitios de unión de los factores de transcripción y la localización de las modificaciones de las histonas se hace mejor por secuenciación del material ChIP. En organismos con un genoma complejo como el humano o el ratón, la línea de base óptima (anticuerpos control, input de ChIP) aún no ha sido determinada. Mínima cantidad: 10 ng de DNA ChIP.
Metilación del DNA
El análisis de múltiples loci para la metilación del DNA aún está en fase experimental. Para proyectos específicos relativos a la metilación del DNA, por favor contáctenos.
Alteración de la expresión de genes
La genética reversa requiere herramientas eficientes para alterar la expresión génica. El FGC pone a disposición de los investigadores del IRB Barcelona y del IBMB (CSIC) alrededor de 200.000 clones para manipulación genética. Estos incluyen todos los clones de Sigma TRC1 para humanos y ratones para disminuir la expresión y los clones de ORF humanos de Open Biosystems para la sobreexpresión (sólo para usuarios del IRB Barcelona). Los clones ORF también son útiles como controles para hibridación in situ y Northern blots.
shRNAs humanos y de ratón
Los clones de shRNA vienen en vectores lentivirales para la infección eficiente de muchas líneas celulares, incluyendo las que no se dividen. De media, ofrecemos a nuestros usuarios internos de 4 a 5 clones diferentes por gen. En muchos casos, los clones que afectan al mismo gen ofrecen diferentes eficiencias de disminución de la expresión y ayudan a controlar los efectos inespecíficos. Aproximadamente el 75% de todos los genes refseq humanos y de ratones cuentan con un clon. La lista completa de los clones shRNA está disponible en www.dnaarrays.org. Hay información detallada sobre los clones TRC1 en la página web de Sigma Aldrich.
Clones ORF humanos
La librería de ORF de Open Biosystems ofrece a los investigadores del IRB Barcelona aproximadamente 13.000 clones para expresión de un ORF por gen. Estos clones se usan frecuentemente para la sobreexpresión de los genes, pero también se pueden utilizar como control. Los clones ORF contienen el sistema “Gateway” para una transferencia sin problemas a cualquier tipo de vector.
La lista de los clones ORF disponibles se puede consultar en www.dnaarrays.org. Hay información detallada sobre los clones ORF disponibles en la página web de ORF de Open Biosystems.
Genómica funcional
General
Consulta inicial
Antes de empezar su experimento, le invitamos a hablar del diseño experimental con nosotros.
Requisitos para los servicios
Cada servicio (distribución de clones, análisis de microarrays, secuenciación...) tiene sus propias especificaciones; los detalles están indicados en los formularios de solicitud de los servicios específicos. Los formularios se pueden descargar desde nuestro sitio web www.dnaarrays.org.
¿Quién puede llevar a cabo proyectos con el FGC?
La plataforma de FGC está disponible tanto para investigadores internos como externos. Trabajamos con instituciones públicas así como compañías privadas.
¿Cómo está organizado el pago de los servicios en el FGC?
En general tenemos dos tarifas, una aplicable a los investigadores del IRB Barcelona y otra para entidades externas. Nuestra política principal es muy transparente: descargue nuestros formularios de solicitud, escriba el número de muestras que le gustaría procesar en una plataforma determinada y el precio se muestra automáticamente. Para investigadores españoles: el Gobierno aún no concede a los institutos de investigación un estatus libre de impuestos. Por lo tanto, el IVA debe ser añadido a los precios mostrados.
Herramientas para el análisis genómico
¿Cuánto tardarán en llegar los resultados?
Para proyectos pequeños de microarrays (<24 muestras), los datos pueden estar disponibles 3 semanas después de entregar las muestras y el formulario de solicitud. Para arrays especiales, los plazos de entrega de los arrays por parte deAffymetrix y NimbleGen pueden ser un poco más largos.
Para proyectos de secuenciación, no es posible hacer una estimación del tiempo por varias razones: Illumina no almacena consumibles en Europa; por lo tanto, y por otras razones internas de Illumina, nuestros encargos pueden verse retrasados. Hay que tener en cuenta que un secuenciador procesa 8 muestras en paralelo. Todas deben tener la misma longitud de lectura y ser del mismo tipo (“single-end” o “paired-end”). Las celdas de flujo deben estar completas para ofrecer el precio indicado en nuestros formularios. Esto significa que o bien el usuario puede llenar una celda de flujo entera con sus muestras o esperar a que otros usuarios deseen hacer algo similar.
¿Qué organismos pueden ser analizados?
Cualquier organismo con un genoma (o transcriptoma) bien conocido puede ser analizado. En el campo de los microarrays, se pueden comprar arrays estándar para muchos organismos. Affymetrix cubre más de 20 organismos, NimbleGen cerca de 100. Los arrays también pueden ser personalizados, un proceso normalmente más fácil de llevar a cabo con NimbleGen que con Affymetrix. En el campo de la ultrasecuenciación, un genoma de referencia del microorganismo tiene que estar disponible. Las secuencias se mapean respecto a este genoma de referencia.
¿Cuál es la mejor forma de preparar mis muestras?
En general, una combinación de extracción de fase orgánica (fenol) con purificación de columna (ej. Quiagen) garantiza un mejor funcionamiento. Estos dos tipos de principios de purificación totalmente diferentes eliminan todas las impurezas. Los protocolos se pueden encontrar en nuestra página web. Para análisis de miRNA, no se deben utilizar columnas ya que casi todas eliminan RNAs cortos. Para muestras muy pequeñas (unos pocos cientos de células) son necesarios protocolos específicos que también están disponibles en nuestra web www.dnaarrays.org.
Tengo dudas sobre la calidad de mis muestras. ¿Todavía puedo enviarlas a analizar?
Antes de empezar un experimento costoso como los arrays o secuenciaciones realizamos una amplia gama de controles de calidad. Estos incluyen el test en el Nanodrop para la pureza, el test de la integridad del RNA en el Bioanalyzer y la cuantificación específica de DNA o RNA utilizando los ensayos Qubit. En caso de dudas sobre las muestras, nos ponemos en contacto con el usuario.
Alteración de la expresión génica
¿Quién puede pedir clones?
El IRB Barcelona tiene un contrato de exclusividad con Sigma y Open Biosystems, es decir que sólo los investigadores del IRB Barcelona y del IBMB CSIC tienen acceso a las librerías Sigma, mientras que únicamente los del IRB Barcelona pueden acceder a Open Biosystems. Si el usuario trabaja para otra organización, debe contactar con Sigma y/o Open Biosystems para acceder a los clones.
¿Para qué genes hay clones shRNA o ORF disponibles?
Nuestros clones shRNA cubren aproximadamente el 75% de los mRNAs refseq de humanos y de ratones; los clones ORF cubren el mismo porcentaje de genes humanos. En nuestra página web se puede encontrar una lista completa de los clones y sus correspondientes genes.
No puedo abrir la lista de clones porque está en formato xlsx
Las librerías contienen más de 65.535 clones. Se requiere Excel 2007 para abrir más de 65.535 filas.
No puedo encontrar mi gen favorito en su lista de clones
Nuestras listas contienen los nombres oficiales de genes tal y como están disponibles en la página web de NCBI. En NCBI, ir al campo de búsqueda, hacer clic en el gen y comprobar si se ha utilizado el nombre oficial.
¿Cuánto tiempo pasa hasta que se reciben los clones?
Envíenos un email con el clon solicitado y le informaremos sobre cuándo deberían ser entregados los tubos para inoculación bacteriana. Los clones se reciben el mismo día que se hace la entrega de los tubos. El proceso tarda un máximo de tres días.
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© Photos by Gianluca Battista/Massimiliano MinocriJefe de Unidad
Herbert Auer
tel +34 93 40 39803
e-mail: herbert.auerirbbarcelona.org
Técnicos de Investigación Senior
Annie Rodolosse
tel +34 93 40 39803
e-mail: annie.rodolosseirbbarcelona.org
Técnicos de Investigación
José Ignacio Pons
tel +34 93 40 34550
e-mail: nacho.ponsirbbarcelona.org
Técnicos Especialistas
David Fernández
tel +34 93 40 34550
e-mail: david.fernandezirbbarcelona.org
Genómica funcional
Waves of early transcriptional activation and pluripotency program initiation during human preimplantation development.
Vassena R, Boué S, González-Roca E, Aran B, Auer H, Veiga A, Izpisua Belmonte JC.
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The DNA-Proteome: Recent advances towards establishing the protein-DNA interaction space
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Accurate expression profiling of very small cell populations
Gonzalez-Roca E, Garcia-Albéniz X, Rodriguez-Mulero S, Gomis RR, Kornacker K and Auer H
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Expression Profiling Using Affymetrix GeneChip Microarrays
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Innate and adaptive immune activation in the brain of MPS IIIB mouse model
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Islet graft response to transplantation injury includes upregulation of protective as well as apoptotic genes
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HOXB4's road map to stem cell expansion
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MYC amplification and polysomy 8 in chondrosarcoma: array comparative genomic hybridization, fluorescent in situ hybridization, and association with outcome
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Acute myeloid leukemia with complex karyotypes and abnormal chromosome 21: Amplification discloses overexpression of APP, ETS2, and ERG genes
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Tissue-wide expression profiling using cDNA Subtraction and Microarrays to identify tumor-specific genes
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