Expresión de proteí­nas

Nicholas Simon Berrow

Jefe de Unidad

Tel Oficina : +34 93 40 20263

correo-e : nick.berrowirbbarcelona.org

Introducción

La Plataforma Científica de Expresión de Proteínas ofrece servicios de alto rendimiento (High-throughput o HTP) para el clonaje y las pruebas de expresión proteica con los que se pueden analizar muchas variables en paralelo: por ejemplo, diferentes truncamientos o mutaciones de la misma proteína, diferentes proteínas de fusión, diferentes medios de cultivo o cepas de expresión, etc. Asimismo, estos servicios HTP también pueden servir para la clonación y el análisis de expresión de un gran número de proteínas distintas del genoma de un organismo particular o de una familia de organismos.

La plataforma ofrece además la posibilidad de producir y purificar grandes cantidades de proteína (del orden de miligramos), tanto en sistemas de expresión de proteínas procariotas como eucariotas: E. coli, Sf9 (para expresión con baculovirus) y HEK293T o HEK293A (células de mamífero).

Muchos de los protocolos de la Plataforma están automatizados gracias al uso de la robótica para el manejo de líquidos y la manipulación de placas  de microtitración (MTP) para los screenings a pequeña escala (Theonyx). También para la purificación de proteínas a gran escala (mg), gracias a un sistema de purificación automatizada (Äkta Xpress).

Figura 1 (arriba). Los vectores pPEU desarrollados por la Plataforma pueden ser usados para analizar la expresión de proteínas y su localización en células HEK293T; en la imagen: dos proteínas fusionadas a la proteína fluorescente Cherry se visualizan por microscopía de fluorescencia.

(abajo a la izquierda) Purificación automatizada a gran escala de proteínas secretadas y glicosiladas a partir de medio de cultivo de células HEK293T; en la imagen: geles SDS-PAGE de dos productos finales.

(abajo a la derecha) Purificación de complejos de proteínas expresados en E. coli a partir de vectores bi-cistrónicos; en la imagen: SDS-PAGE de un complejo purificado.

La plataforma ofrece muchos reactivos de alta calidad para el clonaje y la expresión de proteínas, además de cepas de E. coli altamente competentes y resistentes a bacteriófagos, medios de cultivo específicos para la expresión de proteínas, y enzimas proteolíticos recombinantes. Si se requiere, la plataforma también ofrece servicios de modificación de vectores y de clonaje personalizados.

Contacto

Para información más detallada o cualquier consulta contacte con nosotros:
nick.berrowirbbarcelona.org.

Más información

• 2009 Scientific Report - Protein Expression Core Facility
• 2008 Scientific Report - Protein Expression Core Facility
• 2007 Scientific Report - Protein Expression Core Facility

Expresión de proteí­nas

• Clonación HTP a medida para generar vectores de expresión
  La técnica de clonaje In-Fusion™ es independiente de enzimas de restricción y ligación, y permite la producción precisa de constructos definidos por el usuario, ya sean constructos mutantes, quiméricos o bi-cistrónicos. Para ello disponemos de una amplia gama de vectores pOPIN1 o pPEU disponibles para su uso con In-Fusion™ (ver aquí la lista completa o contacte con nosotros). La mayoría de estos vectores permiten la expresión tanto en E. coli (promotores basados en T7), como en células de mamífero (inmediate early enhancer de CMV fusionado al promotor de la b-actina de pollo) o de insecto (promotor p10 y recombinación in cell de los ORF 603 y 1629 en el genoma de baculovirus), con lo que la expresión de un único clon puede ser analizada en todos los organismos disponibles en la plataforma. Generalmente, el investigador proporcionará el ADN molde para el clonaje, aunque la plataforma también puede proveer plásmidos o cDNAs.
  
  
• Mini- preparación de plásmido HTP
  Preparación de 96 mini-preps a partir de pelets de E. coli en placas de microtitración (MTP)en pocas horas.
  
  
• Análisis de la expresión en E. coli
  El screening de la expresión en E. coli de 96 clones puede llevarse a cabo en tan sólo una semana, gracias al uso de Theonyx y MTPs. Actualmente, el screening general incluye dos cepas de expresión diferentes cuya inducción de la expresión se lleva a cabo por dos métodos diferentes: por IPTG o con un medio de cultivo de auto-inducción. También pueden incorporarse otras cepas (DE3) de E. coli al screening si es necesario.
  
  
• Análisis de la expresión en células de mamífero (p. ej. HEK293T)
  El screening de la expresión de los clones en una MTP de 96 pocillos se puede llevar a cabo en 1-2 semanas.
  
  
• Expresión a gran escala y purificación personalizada de proteínas
  La expresión a gran escala y purificación personalizada del orden de miligramos, tanto de proteínas intracelulares como secretadas, se lleva a cabo incluyendo un mínimo de dos pasos de purificación, que generalmente nos da una pureza de más del 95% para la mayoría de proteínas. Para esta expresión a gran escala, los sistemas de expresión actualmente disponibles en la Plataforma son:
  
  • Diferentes cepas de E. coli
  • Células de mamífero HEK293A
  • Células de mamífero HEK293T; éstas han sido utilizadas con éxito en la Plataforma para purificar miligramos de proteínas glicosiladas secretadas.
  
  Estamos poniendo a punto cultivos de células de insecto como sistema de expresión a gran escala para incluirlo en nuestra lista de servicios.
  
  
• Producción en E. coli de proteínas marcadas con ¹⁵N para RMN
  
  
• Producción de proteínas marcadas con seleno-metionina en cepas de E. coli auxotróficas o prototróficas para determinación estructural por cristalografía.
  El gran volumen de seleno-metionina que compramos hace que nuestras proteínas marcadas con Se-Met tengan un precio muy competitivo.
  
  
• Proteasas recombinantes con cola de histidinas: 3C (PreScission), TEV  y SUMO
  Estas proteasas son ampliamente utilizadas para la separación de las proteínas o colas de fusión de las proteínas de interés, y son fácilmente eliminadas de la muestra gracias a su propia cola de histidinas.
  
  
• Producción de baculo-virus recombinantes
  Ya sea a partir de vectores pOPIN o pPEU o de constructos existentes (p. ej. pFastBac). La recombinación in-cell  (Sf9) de los vectores pOPIN y pPEU con el genoma baculoviral es rápida y sin background.

Próximamente también tendremos disponibles las glicosidasas PNGasa y EndoF1 para la eliminación de parte de los azúcares de las proteínas recombinantes glicosiladas como paso previo a la cristalización.

La plataforma también ofrece reactivos de alta calidad, como células altamente competentes de diferentes cepas de E. coli, reactivos para la clonación, la expresión y el marcaje de proteínas, etc. Todo ello disponible para investigadores del IRB Barcelona a precios muy competitivos.

¹- El vector pOPIN se desarrolló en la Oxford Protein Production Facility, ver también:
Berrow NS, Alderton D, Sainsbury S, Nettleship J, Assenberg R, Rahman N, Stuart DI and Owens RJ. A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications. Nucleic Acids Res, 35, e45 (2007) In-Fusion™ is a trademark of Clontech Laboratories, Inc.

²- El rendimiento depende enteramente de la proteína particular que se esté expresando y obviamente no se puede garantizar.

Expresión de proteí­nas

Generalmente llevamos a cabo diferentes pasos de diferentes proyectos a la vez, e intentamos dar cabida a cualquier petición razonable tan pronto como nos sea posible.

Por favor no dude en consultarnos sobre cualquier pregunta relativa a posibles proyectos o colaboraciones con la Plataforma Científica de Expresión de Proteínas.

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© Photos by Gianluca Battista/Massimiliano Minocri

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